靶向测序是通过富集目标基因组编码区或定制区域，再结合二代测序（NGS）完成测序的高性价比技术。凭借高特异性、高覆盖深度、低成本等优势，该技术广泛应用于肿瘤基因突变检测、药物敏感性与耐药性分析、遗传病诊断筛查、肿瘤异质性评估、微生物组测序、临床试验筛选及液体活检等场景，是临床个体化治疗的优选测序方案。
当前市售靶向测序试剂盒的主要差异，集中在DNA 片段化方式，主要分为超声法、酶切法、转座酶法三类。本文选取 SureSelect Custom Target Enrichment  Library Preparation、HaloPlex Custom Exome Library Preparation、Nextera Custom Enrichment Library Preparation、SeqCap EZ Choice Library Preparation四款代表性商用试剂盒，从测序数据比对率、均一性、GC 偏好性等关键指标，系统评估三类技术的性能差异。

图1 各类文库指标的比较。A：文库插入片段大小（图中均展示中位数与绝对偏差）。B：文库复杂度，以文库中唯一读长占总读长的百分比进行评估。C：各试剂盒比对至hg19参考基因组及靶向区域的读长比对指标（SureSelect、Nextera、SeqCap 已去除重复序列）。D：各试剂盒链特异性，以正链碱基识别数量为评价依据。

图2 共同靶向区域测序深度与变异分析。A：对每个共同靶向碱基计算归一化覆盖率（每百万测序读数的覆盖读数），以基因组位置为横轴，归一化覆盖率为纵轴，绘制平均值（蓝色）与标准差（红色）曲线。B：平均最小归一化覆盖率下，共同靶向碱基的覆盖百分比（实线）；虚线为对应技术的理想均匀覆盖曲线，不同试剂盒因平均归一化覆盖率差异，理想曲线有所不同，实线与虚线的偏差反映均一性水平。C：100bp窗口内GC含量百分比与平均归一化覆盖率的关联分布，颜色深浅代表数据点密度高低。

实测数据表明，相比酶切法或转座酶法，采用超声法进行DNA片段化的试剂盒所构建的文库具有最高的复杂度。尽管HaloPlex试剂盒与目标区域的比对百分比最高，但大多数比对数据实际上是重复序列，涉及过度测序，因此导致均一性较低（图2B）。与SureSelect和SeqCap试剂盒相比，HaloPlex和Nextera试剂盒的归一化覆盖度标准差最高（图1B），且与各自的理想曲线偏差更大（图2A）。此外，GC含量低或高的区域会通过影响探针杂交和 PCR 扩增步骤，对靶向DNA测序产生不利影响。HaloPlex和Nextera在 GC 含量接近 60% 时，归一化覆盖度出现显著峰值，而在 GC 含量偏离 60% 前后，覆盖度均急剧下降。相比之下，SureSelect和SeqCap的测序性能随GC含量变化保持稳定，且在任意GC百分比下均无明显峰值（图2C）。

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参考文献：J Mol Diagn 2015, 17: 64-75；DOI: 10.1016/j.jmoldx.2014.09.009